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干货 | 诺奖技术：噬菌体展示技术详细解读

发布: 2018-12-05 1,080阅读 210评论

当2018年诺贝尔化学奖颁布的那一刻，我禁不住高呼一声：今年的三大自然科学奖项都被生物学给“收入囊中”了。别的不说，就说噬菌体展示技术，经过义翘神州十多年的应用改善，已经成为公司抗体制备技术的主要手段，制备开发的抗体近万种，还有几种抗体药物也在临床试验阶段。

为了让大家对噬菌体展示技术有更加清晰的了解，我结合公司十多年的抗体研发生产经验写了本文，希望给大家带来帮助。

噬菌体展示技术的发展进化之路

1985年Smith GP利用基因工程，将外源基因插入丝状噬菌体(Filamentous bacteriophage，fd)的基因组，使目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示，从而创建了噬菌体展示技术。
1990年，Mc Cafferty等利用噬菌体展示技术构建了库容为106的抗体库，使其成为一种新兴的抗体制备技术。
而Sir Gregory P. Winter是第一个利用噬菌体展示技术将鼠源抗体药物人源化，使得抗体药物用于临床治疗，比如Adalimumab。

噬菌体展示技术创建后就成为了生物学研究中的重要研究手段，从根本上改变了传统单克隆抗体制备流程（杂交瘤技术），被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。随着技术的不断发展完善，还进化为多种展示技术，如核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等。

噬菌体展示技术的原理

噬菌体展示技术（phage display）是将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框能正确表达，使外源多肽或蛋白在噬菌体的衣壳蛋白上形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，可以保持相对的空间结构和生物活性。
然后利用靶分子，采用合适的淘洗方法，洗去未特异性结合的噬菌体。再用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。
下图展示了噬菌体抗体库制备的简单过程：

噬菌体展示技术的分类

噬菌体展示技术有多种分类标准。根据噬菌体的不同，可以分为M13、T7、T4、λ等多种体系；根据载体的不同，可以分为噬菌体载体（True Phage）和噬菌粒载体（Phagemid）；根据文库的不同，可以分为随机肽库、cDNA文库、抗体文库、蛋白质文库等。

1. M13噬菌体展示系统

M13噬菌体属于单链环状DNA病毒，其基因组为6.4 kb，编码11种蛋白，其中5种为结构蛋白，包括主要衣壳蛋白的PⅧ和次要衣壳的pⅢ、pⅥ、PⅦ和PⅨ。其中，pⅢ和PⅧ是噬菌体展示中最常用的两种蛋白，构建了pⅢ和PⅧ展示系统。pⅢ由406个氨基酸构成，分布在噬菌体颗粒的一端。一般一个噬菌体有3-5个拷贝的pⅢ蛋白，可在N端的柔性连接区插入外源蛋白或者多肽。pⅢ系统的主要优点是对展示的外源蛋白大小无严格的要求，该系统可以用来展示分子量较大的蛋白。主要衣壳蛋白PⅧ的分子量为5.2 kDa，主要分布在噬菌体颗粒的两侧，每个噬菌体大约含有2700个拷贝。由于PⅧ蛋白拷贝数较多，该系统比较适合用来筛选低亲和力的配体。由于该蛋白的分子量很小，只适合用来展示外源短肽。外源肽段的太大会影响病毒包装，不能形成有功能的噬菌体。

2. λ噬菌体展示系统

λ噬菌体是长尾噬菌体科的一种温和噬菌体，有直径55nm的二十面体头部，末端有细长尾丝。基因组为48.5 kb的线性双链DNA分子，有黏性末端即单链延伸12个核苷酸，感染后线性基因组可立即环化。噬菌体的头部由D蛋白和V蛋白构成，可以构建D蛋白和V蛋白的展示系统。λ噬菌体是在宿主细胞内完成装配的，无需将外源肽或蛋白分泌到细菌胞膜外，可展示有活性的大分子蛋白质（100 kDa以上）及宿主细胞有毒性的蛋白质，适用范围极广。

3. T4噬菌体展示系统

T4噬菌体基因组DNA为双链线形，呈环状排列，噬菌体衣壳的有两种非必需外壳蛋白：SOC(small outer capsid protein)和HOC(highly antigenic outer capsid protein)。T4 噬菌体表面展示是将外源多肽或蛋白质分别与SOC位点的C末端和HOC位点的N末端融合而展示于T4噬菌体表面。T4噬菌体的主要优点是可以实现SOC位点和HOC位点同时展示，展示的拷贝数也较多。

4. T7噬菌体展示系统

T7 噬菌体基因组为线性双链DNA，其衣壳蛋白通常有两种形式，即10A(344个氨基酸残基)和10B(397个氨基酸残基)，10B衣壳蛋白区存在于噬菌体表面，所以被用来构建噬菌体展示系统。T7噬菌体展示系统可以高拷贝展示50个氨基酸的多肽，以低拷贝量(0.1-1/噬菌体)或以中拷贝量(5-15/噬菌体)展示1200个氨基酸残基的多肽或蛋白质。因此，广泛应用于筛选不同分子量，不同亲和力的蛋白质。

噬菌体抗体库筛选方法

抗体库的筛选是指从抗体库中筛选出针对某一抗原的特异性抗体，是获得高亲和力抗体过程中的关键环节。单克隆抗体性质存在千差万别，需根据不同的单抗制定严格的筛选条件，一般分为经典筛选法和新型筛选法。

1. 经典筛选法：
主要为固相筛选法和液相筛选法，用于抗原性质明确的抗体筛选。固相筛选法通过包被在酶标板或其他固相介质上的抗原富集高亲和性的噬菌体；液相筛选法是将生物素化的抗原包被在与亲和素偶联的磁珠或琼脂糖上，进行抗原特异性结合的方法。通过多次筛选，抗原得到高亲和力的噬菌体。

2. 新型筛选法：
当抗原无法纯化或性质不明时，就需要开发新的筛选方法，用于抗体库的建立。目前比较成熟的有细胞筛选法、组织切片或体内筛选法、选择感染筛选法、蛋白质芯片筛选法等。细胞筛选法可以维持抗原和抗体的天然构象，多用于肿瘤细胞抗体筛选，还适用于细胞表面受体及抗原鉴定。但由于细胞膜表明成分复杂，会增加非特异性结合，而多次筛选又容易丢失特异性结合的抗体，因此限制了此方法的应用，并且在此方法基础上开发了扣除筛选、竞争筛选、内化筛选等方法。

组织切片或体内筛选法多用于临床研究。组织切片是利用新鲜的组织切片进行抗体筛选，但由于组织本身抗原数量有限，也就限制了噬菌体抗体的回收效率。体内筛选是将待筛选抗体库通过静脉注射进小鼠体内，然后取出组织或靶器官，回收噬菌体，经过3-4轮的富集可得到特异性抗体。

选择感染筛选法是将PⅢ蛋白的氨基端结构域（NT）用特定的多肽或蛋白替代，然后这些多肽或蛋白与带有NT端的配基特异性结合时，才会有感染能力，因此在细菌细胞内繁殖富集，得到特异性抗体。

蛋白芯片筛选法利用高通量蛋白功能分析技术，在载体上有大量不同种类的蛋白质，可以同时检测大量的抗原抗体反应，通过扫描仪对荧光强度进行读取，可以高通量、高灵敏和低假阳性的筛选抗体。

 

噬菌体抗体库的优势及其应用

噬菌体展示技术构建抗体库省去细胞融合步骤，避免了因杂交瘤不稳定而反复亚克隆的繁琐程序，极大的提高库容量，从杂交瘤的几千个克隆升至106个。噬菌体展示技术可以直接得到抗体基因，便于进一步构建各种基因工程抗体，还可用于一些难于制备的抗体，如弱免疫原、毒性抗原等，以及人源化抗体。由于噬菌体展示技术周期短，在细菌中增值，因此适用于抗体的大规模工业化生产。
噬菌体抗体库的巨大优势，让其在后基因组时代具有多种应用。

利用噬菌体展示技术，可以筛选出与抗体特异性结果的噬菌体，获得该抗体识别的抗原表位，进行抗原表位分析，为研究抗原抗体反应机制、诊断试剂开发、疫苗制备等提供依据。
单抗药物需要抗体人源化，并且药物靶点趋于多样化，比如常见的细胞因子药物，有些可以识别多个抗原表位，因此需要利用噬菌体抗体库进行研究，才能开发出科技含量高、市场竞争力高、治疗效果好的单抗药物。

双特异性抗体药物已经成为目前药物开发的主要方向。双特异抗体是通过基因工程技术将两个分别靶向不同抗原的抗体片段组合在一起，使其具有两种抗原结合位点，发挥协同作用，提高治疗效果。由于双特异抗体种类繁多，噬菌体抗体库能有效的提高开发效率。

当然，噬菌体抗体库技术也存在一些不足，有许多方面需要改进，如提高抗体库的库容及多样性，优化筛选方法获得高亲和力的抗体，克服淘选过程中的阳性克隆丢失及假阳性克隆。随着蛋白质组学、分子模拟技术等的发展完善，将会推进噬菌体抗体库构建技术及其在蛋白质学研究、药物研发、疫苗研制等领域的发展。

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