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荧光蛋白与发荧光的蛋白不一样

发布: 2018-12-12 865阅读 200评论

所有的蛋白都可以发出荧光，但并不是所有的蛋白都叫作荧光蛋白。就像”并不是所有的牛奶都叫特仑苏”一样（拜托~这一点都不一样好吗Orz）。

普通蛋白质发光原理

所有的蛋白都可以发出荧光吗？原则上是的。在蛋白质分子中, 能发射荧光的氨基酸有色氨酸(Trp )、酪氨酸(T yr) 以及苯丙氨酸(Phe)三种。个别蛋白质分子含有的黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD ) 也能发射荧光。Trp、Tyr 以及 Phe 由于其侧链生色基团的不同而有不同的荧光激发和发射光谱。其中 Trp 的荧光强度最大, Tyr 次之, Phe 最小。

上图是三种能发出荧光的氨基酸结构，可以发现，三种氨基酸都都属于芳香类氨基酸。发出荧光通常在 280 nm 或更长的波长被激发，如果想选择性的激发色氨酸，要选择295 nm的波长。 Phe 在 绝大多数实验条件下不被激发, 所以很少能观察到 Phe 的发射。因此，蛋白质的内源荧光主要来自 Trp 和 Tyr 残基。Trp 残基对微环境的变化很敏感, 并且大多数蛋白质都含有几个不同的 Trp 残基, 因而常作为内源荧光探针来研究溶液状态下蛋白质的构象。

普通蛋白质荧光的应用

色氨酸发出的荧光是如何根据微环境变化而变化的呢？ 这个问题很有趣。当蛋白质处于折叠状态时，如果在蛋白质内部含有色氨酸，色氨酸周围的环境主要是疏水的，此时色氨酸发出的荧光的强度会很高，同时发出荧光的最大光强度在波长330 nm处。当蛋白质处在解折叠状态时，色氨酸完全暴露在溶液中，周围环境是亲水的，此时色氨酸发出荧光的强度会变低，同时发出荧光的最大光强度的波长会增大，移动到350 nm处（如下所示）。

上图是IgG样品在25 °C（蓝，绿）和90°C（红，紫）的荧光光谱。在低温时，蛋白质处在正常折叠状态；而当升高温度后，蛋白质发生了折叠。这些信息可以从发光光谱中很好的显示出来。将蛋白质置于不利环境，比如变性试剂，不同pH，不同温度下，即可利用荧光的信息研究蛋白质的构象变化，甚至测定蛋白质的解折叠温度等信息。

荧光蛋白发光原理【1】

为什么说并不是所有发光的蛋白都是荧光蛋白，这是因为荧光蛋白的发光原理是不一样的。

绿色荧光蛋白（GFP）是常用的荧光蛋白质之一，我们拿GFP举例说明一下。GFP是一个由238个氨基酸残基组成的蛋白，根据其晶体结构显示，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于桶的大空腔内（如下图）。实验表明GFP荧光产生的前提是桶状结构完整性，去除N端6个氨基酸或C端9个氨基酸，GFP均会失去荧光。

荧光蛋白的发光原理是咋样的呢？GFP含有一个荧光发色团（上图球状显示），这个发色团由65至67位的三个氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）残基组成。当蛋白质链折叠时，这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段，得以“亲密接触”，导致经环化形成咪唑酮，并发生脱水反应。在分子氧存在的条件下，发色团可进一步发生氧化脱氢，最终成熟，形成可发射荧光的形式。具体过程为：在 O2存在下，GFP分子内第67位甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基进行亲核攻击，形成第5位碳原子咪唑基；第66位酪氨酸的α2β键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合，并最终自发催化形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色。

GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。一般来说弱还原剂并不会影响GFP荧光，中度氧化剂如生物材料的固定，脱水剂戊二酸或甲醛等对GFP荧光影响也不大。

荧光蛋白发光特性

GFP吸收的光谱最大峰值为395nm（紫外），并有一个峰值为470nm的副吸收峰（蓝光）；发射光谱最大峰值为509nm（绿光），并带有峰值为540nm的侧峰（Shouder）。虽然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于该激发光对细胞的伤害更小，因此通常多使用该波段光源（多为488nm）。

GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比荧光素强，特别是在450～490nm蓝光波长下更稳定。类似的，GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。由于GFP荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白，比如萤火虫荧光素酶等。

荧光蛋白的应用非常的广泛（如上图），  已经应用于分子标记，体内示踪，信号转导，药物筛选等生物科研的各个方面。

荧光让我们能够检测分子的构象变化，也能让我们追踪化学反应…. 是科学研究的重要手段之一。与荧光相似，生物发光也常用在实验室中。与荧光不同，生物发光不需要激发光照射。感兴趣的童鞋可以看我们的往期的科普文章哦~

送你一条谢耳朵的发光鱼，你愿意养吗？

Reference

[1] https://www.loybio.com/biowiki/t2601/

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