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靶向蛋白-蛋白相互作用在药物设计中的应用

发布: 2017-07-08 7,234阅读 91评论

靶向蛋白-蛋白相互作用长期以来被认为是一项非常困难的任务，但在过去十年中成功案例的数量增长非常迅速。考虑到小分子方法的优势和缺点，以及人造抗体，肽或模拟肽的选择或设计等替代策略，本文概述了该领域近期进展。

蛋白-蛋白相互作用
随着FDA批准的新药数量减少，医药研发也经历着生产力的下降。市场力量、需求与竞争使得医药研发越来越具有挑战性。对疾病机制理解的进步表明，可以剖析复杂和多因素系统，以确定可靠、安全和有效的药物。

疾病的起源往往在生物相互作用的复杂网络中，不仅需要在临床水平上，还要在表型和分子水平上进行理解。从这个角度来看，已经开发了广泛的“ 组学 ” 方法，希望正在积累的数据，可以用于个性化治疗。其中，蛋白质组学方法导致在不同模型物种和几种人类细胞系中建立蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction：PPI）网络。

PPI网络是高度互联的，一些蛋白质表现为中枢，并且涉及大量的相互作用。中枢蛋白的典型实例是网络中显示为中心节点的人蛋白质p53，发现在多种类型的癌症中突变。导致抑制蛋白功能的突变可能影响PPI网络，仍然很难预测突变对PPI网络的影响有多远。预测各种细胞类型或组织中表型的突变后果仍然没有达到。

破译与PPI网络相关的分子合理性仍然是未来十年基础研究和药物研发的重大挑战。几十年来，药物研发已经产生能够抑制与疾病相关的许多蛋白质靶标的活性分子，或者靶向于主要和复杂细胞途径的G-蛋白偶联受体（GPCR）。这样的分子可以用作干扰PPI网络的工具，并评估相关的细胞反应。历史上，制药公司将精力集中在靶向位于细胞表面或细胞内酶的GPCR上，因为这些靶标存在围绕其活性位点的空腔。然而，这些靶标通常在PPI网络中占据中心位置，其活动通常会影响与其相关的通路。

设计蛋白-蛋白相互作用的特异性抑制剂可以代替PPI网络中高度互联节点多效抑制剂。这些抑制剂不仅有助于解开互连网络的复杂性，而且可以提供更广泛的药物靶标。

小分子调节剂
发现与细胞内蛋白质伙伴竞争结合的小分子是一项艰巨的任务。设计抑制PPI的小分子的一个难点与应该被分子覆盖的表面的大小有关，而抑制酶的活性位点一般通过占据酶的功能腔来实现。与酶的活性位点或受体的结合位点相比，PPIs通过由蛋白质原子埋藏形成的大界面稳定，达到数千平方埃。除了与表面尺寸竞争的难度之外，PPI界面还代表着多样化和多方面的结合位点，在构建有效的抑制剂方面构成重大挑战。

寻找小分子PPI抑制剂的第二个难题在于缺乏筛选催化活性，或缺乏用于筛选靶向激动剂或拮抗剂的简单功能测定技术。在PPI的情况下，必须重新审视高通量筛选（HTS）。或者，已经开发出测量使用反向两种杂交或BRET的相互作用丧失的高通量蜂窝筛选，并且提供仅选择细胞可穿透分子的优点。

由于八十年代蛋白质结合界面能量分析的出现，小分子PPI抑制剂得到了持续有力的发展。通过丙氨酸扫描技术探索在发生结合时不同接触的贡献。这种技术表明，界面残基的一些突变对两个分子的结合亲和力几乎没有影响，另一些突变主要是不稳定的效应。在热点位置相互作用的小分子应与同源伴侣的结合形成竞争，而不必覆盖整个相互作用的表面。

作为小分子PPI抑制剂开发的积极步伐，热点位置与蛋白质多重结合位点的位置相关。定义这些位点为蛋白质同源家族表面的残基，它们对应于稳定天然蛋白质协助伙伴的相互作用中起着关键作用的蛋白质的“粘性区”，并且易于结合小分子。最新的研究显示这些粘性区域富集了抑制剂结合能，为合理选择结合分子开拓了新的思路。

在较大的蛋白蛋白界面中，热点可以在界面上分布得更多，其间距相当大。它们还涵盖了更复杂的化学功能组合，增加了发现所有热点抑制剂的难度。PPI抑制剂显示出比传统药物更大的尺寸和分子量。PPI抑制剂也更具疏水性，它们含有更多数量的氢键和至少四个环。这种与经典特征的偏离指出了组合专用于PPI筛选的分子库的必要性，其含有比传统药物设计的化合物库更高的化学多样性和更大的复杂性。对天然产物的进一步探索通常应该有助于多样化和补充这类化合物。用于搜索PPI抑制剂的计算工具也与实验筛选相结合，以加速筛选和降低成本。

化合物库组合的另一种方法称作 “片段方法”。它不是选择分子量相对较高的起始分子，而是对一个协助伙伴进行一组简单的低亲和力小分子片段搜索，并通过基于结构的策略逐步建立抑制剂。对于该策略，结合热点的确定对于定义分子可以有效结合与同源伴侣竞争的关键位置特别有用。在前期的筛选中采用X射线或NMR技术直接进行基于结构的筛选取得成功。可以基于其结合位点直接选择起始分子。即使起始化合物的亲合力落在毫摩尔范围内，通过扩大分子大小同时优化结合亲和力来优化已经足够。也可以使用晶体接触来找到新的结合位点，并通过连接片段增加分子的大小。选择第一个片段的另一个成功的策略是通过SS键在接近靶向PPI相互作用的位置上束缚分子。在该策略中，靶标和初始片段化合物之间共价键的存在有助于获得复合物的结构。

蛋白调节剂
当靶标相互作用包括大的PPI作用界面时，需要寻找小分子方法的替代方案。第一类开发策略是与PPI形成竞争的单克隆抗体。这种使用人源化免疫球蛋白以防止免疫反应的方法非常成功，因此每年有数十种新抗体开始进行临床试验或获得FDA批准用于治疗或诊断。

在这一领域计算方法也做出了重大贡献。建模和设计工具，如Rosetta已经达到了足够的准确性以便能够指导结合剂的合理设计。将合理的设计策略与最先进的显示技术相结合，为结合剂类的多样化打开了很大的视角。计算方法也可用于设计降低蛋白的免疫原性。

设计用于抑制PPI的天然、工程或人造抗体通常被认为与同源协助伙伴竞争；但在少数情况下，他们也通过变构机制发挥效应。然而，由于蛋白质构象的微妙变化，后一种效应机制难以合理化或预测。

最后，选择用于紧密结合靶标的抗体、纳米抗体和其他蛋白质的主要限制仍然是这些蛋白质进入细胞的困难。它们的应用主要限于细胞外靶标。

肽和肽拟似物
肽是足够大的天然化合物，可能阻碍PPI相互作用和命中几个热点。然而，靶向细胞内PPI时，肽抑制剂必须跨过细胞膜。目前细胞穿透肽（CPPs）方面取得了重大进展，这为细胞内肽样药物的发展带来了显着进步。特定肽序列穿透细胞的能力首先在神经递质和病毒蛋白的小蛋白中发现。然后深入研究渗透机制，突出显示各种机制，具体取决于仍在调查中的CPP类型。进入细胞涉及内吞吸收，但也可直接穿越膜。通过在N或C末端添加CPP序列或通过在不干扰靶标结合的位置修饰肽的带正电荷的残基，将CPP性质转移到活性抑制肽。渗透序列是变化和优化的，并且引入化学修饰。

关于肽策略的一个重点是，通过已经开发用于蛋白质或抗体的方法，即分子生物学，定向进化，计算设计工具等，可以改进肽对靶标的亲和力。后一种计算方法需要具体考虑到与球状蛋白相比肽增加的灵活性。肽策略的另一个优点是从中受益的简单合成步骤几十年的固相化学合成开发。因此，可以容易地建立用于检测第一肽命中的高通量方法，例如肽阵列或对同源靶标的肽选择性的研究。

肽作为药物的主要限制仍然是它们对体内蛋白酶的高度敏感性，即使快速内化显示出部分保护。为了克服肽类药物相关的这种障碍，文献中已经提出了大量的化学修饰增加与天然肽支架的偏差，PPI抑制有一些显著的成功。进行非天然侧链的引入以通过优化靶标接触同时增加溶解度或限制蛋白水解来增加亲和力。可以在有限的肽构象扰动的某些位置引入D-氨基酸。肽环化还通过设计简单的环肽或引入结合剂进行。螺旋钉不仅显示出稳定的螺旋构象，而且有利于细胞穿透和保护肽免于蛋白水解。与天然肽更为不同的是，非α-氨基酸骨架的低聚物被设计成保持其形成定义良好的结构的能力。可以设计这些所谓的折叠物，以保持锚定残基与蛋白质靶标相互作用的位置，同时具有超过100倍的蛋白水解抗性。有趣是，折叠剂的合成在一些情况下可以适应于固相合成，促进其生产和纯化。此外，目前为了折叠体的合理设计开发了计算工具，所有这些努力都应该为抑制任何PPI靶标铺平道路，而不限制与界面竞争的尺寸和组成。

总结
抑制蛋白质相互作用已经具有大量实例，并且可以被设想为更一般的策略来破译与PPI网络相关的分子逻辑，或用于治疗应用。根据靶标界面的大小，交互的亲和力和热点的位置，可以设想不同的策略。小分子更适用于小型和紧凑的界面，而通过使用肽模拟物更可能实现对大界面的抑制。抗体被认为是靶向细胞外受体的首选方法。在一些实例中，肽用作第一分子以验证目标并促进搜索活性肽拟似物或小分子。

考虑到寻找PPI抑制剂，需要扩大化学空间以有效筛选小分子，并且应该优先聚集专门的化合物库。也可以选择核酸适配子（aptamer）结合蛋白质表面并抑制蛋白质相互作用。设计广泛的肽模拟物的开发工作仍在进行中，应增加有助于靶向PPI的分子化学空间。这种分子的主要障碍可能是免疫反应。最后，如果干扰PPI的研究不断取得进展，那么能够恢复由致病突变引起的PPI损失的分子仍然限于特殊情况。这种分子在开发遗传性疾病中的新药物将是非常有意义的，这可能是该领域即将到来的重要挑战。

参考资料
1.Bakail M, Ochsenbein F. Targeting protein–protein interactions, a wide open field for drug design[J]. Comptes Rendus Chimie, 2016, 19(1): 19-27.

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