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不谈原理谈技术：qRT-PCR怎样才能做到“三线合一”

发布: 2017-06-01 363阅读 98评论

实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是分子实验室家喻户晓的基因表达定量技术。无论是刚入实验室的菜鸟，还是久经沙场的老手，都需要时不时用一下这个高大上的技术来进行转基因的检测、突变体的鉴定、组织表达的定量或标记基因的表达。对于大多数老手而言，qRT-PCR不过是配一板PCR体系丢到机器里去，静等两个小时结果出来的一个小实验。然而对于刚进实验室不久的生物小白们，花了两周时间从各大平台和课本中好不容易掌握了SYBR Green的发光原理、Ct值的定义、甚至可以根据ΔΔCt公式手算定量结果，真正开展实验时，却发现自己面对的唯有一机器、一酶、一PCR板、一移液枪而已。

所以说，qRT-PCR的体系究竟要怎么配置？和普通的PCR有何区别？如何选择合适的酶？如何加样才能避免污染？怎么配体系才能做到“三线合一”？配完体系后有又如何进行程序及参数设定？你是不是掌握了qRT-PCR所有原理但操作起来还是无从下手？如果你并不知道这些实验干货，赶紧搬好小板凳，拿出记录本，这篇文章就是为你而准备的。

qRT-PCR的引物设计注意事项

qRT-PCR有自己的引物标准，简单而言，引物设计要用专门的软件，包括内参基因与目的基因在内的所有引物Tm值不应相差两度。扩增片段的长度以200-300 bp为宜。除此之外，还需要注意以下法则：1）用于突变体的基因表达量鉴定时，引物最好设在两个外显子之间，横跨中间的内含子，这样可以避免DNA的污染；2）用于过表达基因表达量时，需找出该家族所有同源基因并进行比对，并在保守性最差的区域设计引物；3）用于标记基因检测的引物序列最好来自发表的文献。

除此之外，内参基因的选择也需要稍微走下心。以模式植物拟南芥为例，常用的内参基因Actin2和Actin7虽然在营养组织有稳定的高表达，但在花粉、胚胎及种子部位几乎无表达。因此如果进行组织特异性表达测定时我们应该选择28S，而不是Actin2或Actin7。当然，这些内参基因的引物序列也最好引用自发表的文献。

最后值得注意的是，引物用完后需放入-20℃保存。尽量避免反复冻融，如果多次使用可在第一次溶解好后进行分装。如果在实验过程中出现以前能扩增的基因扩不出的现象，多半是引物降解或部分降解导致的。在实验期间引物解冻后需用涡旋混匀，离心待用。
qRT-PCR的模版需求

通常而言，如果你想做一个突变体鉴定实验，那么模版质量要求可适当放宽，只要cRNA反转录成功即可。但如果你要做一个厉害的标记基因鉴定，并且想要达到传说中“三线合一”的境界，那么模版质量就另当别论了。首先，RNA要经过严格的定量（因为反转成cDNA后，反转时加入的dNTP会严重干扰定量结果，因此对cDNA定量是没有意义的）。尽量取等量的、未降解的RNA进行反转录（并选择含有DNAase的试剂盒）。反转好的cDNA模版需一次性稀释20-30倍，不可长期保存，每次用时前先混匀再离心。qRT-PCR实验最好在一个星期内完成。

qRT-PCR中SYBR Green酶的选择

工欲善其事，必先利其器。高质量的酶是保证高质量结果的前提。现在市售的酶多为2 X MIX的形式。在市售酶的选用方面，我们首先应该选择稳定、扩增效率高的酶，其次还应注意解冻后的MIX粘性不宜过大（粘性过大的MIX会导致加样时枪头出现挂液），最后应注意同一板qRT-PCR体系不宜用两管MIX，即加完一管发现不够用，继续开一管新的MIX接着加。正确的做法应为先估算总体系，将两管MIX预先加到一起，混匀后离心，用混匀的MIX配置体系。

qRT-PCR中体系的配置

qRT-PCR要求对每个样品做三个平行体系。一般来说，每个最终的反应体系为10μl（然而试剂盒上推荐的体系为25 μl，但这样既浪费酶，用中号枪头加样还降低了重复性）。最好用10 μl小号进口枪头加入。

配体系时，一般先将水、MIX及引物混成3倍体积的总体系（此时应给每管留1.5ul的损耗，另外有些仪器还要求加入适量Passive Reference Dye用于标定仪器），再用排枪分装入qRT-PCR板。模版要在最后，最后，最后用排枪加入（稀释20-30倍后，模版可加至1 μl以上，大大提高了可重复性）。

最后附一些实用的qRT-PCR体系配置技巧：
1）在冰上配置体系；
2）所有的枪头和PCR板都用进口的；
3）尽量用排枪进行平行操作，尽量用同一枪头完成样品分装；
4）模版加在管壁上，这样在不换枪头的前提下可有效避免样品污染，最后用96孔板离心机离心。

qRT-PCR程序的设置

目前市面上有许多进口或国产的qRT-PCR仪器，关于这些仪器的参数设置，我们可以请教师兄师姐或拨打公司的服务热线。

而反应程序的设置，则需要参考购买的SYBR Green酶的说明书。值得注意的是，虽然说明书中大多数SYBR Green酶的扩增效率都显得牛逼闪闪（如三步法时循环部分的程序为95℃ 30s，50-60℃ 5s，72℃ 15s），但倘若扩增效果不尽人意，适当延长退火及扩增时间也许会大有帮助哦。

好了，有了这么多qRT-PCR体系的配置技巧，小伙伴们只要做到不染风尘、心无旁骛、人枪合一，稍加练习后，配制高质量的qRT-PCR体系必将不在话下。

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评论列表(98)

  9. Garrett picks up the pee-stained and cum-leaked jock from the tile floor. The now lukewarm water streams through the curls of his hair rinsing away the last vestiges of the soapy lather. It all goes down the drain in a swirl of bubbles.

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  40. Great write-up! Your analysis is spot-on. For those wanting to explore more, this link is helpful: FIND OUT MORE. What are your thoughts?

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  98. 关于设计引物那里，我接触的要求扩增片段长度为90~150bp；
    想排除基因组DNA污染，还可以反转录前将总RNA用DNA酶消化一下，当然，最好还是跨内含子或者跨外显子设计引物。

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